Sekilas tentang Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) atau Reaksi Polimerasi Berantai adalah alat yang relatif sederhana dan murah yang dapat digunakan untuk memusatkan perhatian pada segmen DNA dan menyalinnya miliaran kali atau dapat disebut juga amplifikasi nukleotida secara in vitro. PCR digunakan setiap hari untuk mendiagnosa penyakit, mengidentifikasi bakteri dan virus, dan dalam banyak hal lainnya

Ada berbagai macam jenis atau metode PCR, antara lain adalah sebagai berikut ini.

1. Multiplex PCR

Multiplex PCR merupakan adapatasi dari PCR yang memungkinkan amplifikasi secara simultan dari berbagai sekuen atau urutan. Teknik ini digunakan untuk diagnosis penyakit yang berbeda dalam sampel yang sama. Multiplex PCR dapat mendeteksi pathogen yang berbeda dalam satu sampel. Juga dapat digunakan untuk mendeteksi urutan exonic dan intronic dalam gen tertentu (Gambar 2) dan penentuan dosis gen (gambar2, 3, dan 4). 

Hal ini dapat dicapai ketika dalam tabung tunggal mencakup sepasang primer spesifik untuk target yang berbeda. Pada metode PCR ini, desain dari prier sangat penting karena primer harus ditandai dengan aturan urutan DNA spesifik pada suhu yang sama.

  2.    Nested PCR

Metode PCR ini meningkatkan sensitivitas yang disebabkan target dalam jumlah kecil dideteksi dengan dua pasang primer, melibatkan proses ganda dari amplifikasi. Set primer pertama  memungkinkan amplifikasi pertama. Produk PCR ini dikenakan PCR kedua menggunakan set primer kedua. Primer yang digunakan pada PCR kedua adalah khusus untuk urutan amplifikasi internal pada PCR pertama. Oleh karena itu, spesifisitas produk PCR pertama diverifikasi dengan yang kedua. Kerugian dari teknik ini adalah kemungkinan kontamunasi selama transfer dari produk amplifikasi pertama ke dalam tabung dimana amplifikasi kedua akan dilakukan. Kontaminasi dapat di kendalikan menggunakan primer yang didesain untuk menempel (anneal) pada temperature yang berbeda. Kontaminasi dapat juga di kendalikan dengan menambahkan minyak ultra murni untuk membuat pemisahan fisik dari kedua campuran amplifikasi.

  3.    Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

PCR ini didesain untuk mengamplifikasi urutan RNA (khususnya mRNA) melalui sistesis dari cDNA (complementary DNA) dengan enzim reverse transcriptase (RT). Kemudian, cDNA ini diamplifikasi menggunakan PCR. PCR jenis ini telah digunakan untuk diagnosis RNA virus, serta untuk evaluasi terapi antimikroba. Hal ini juga digunakan untuk mempelajari ekspresi gen in vitro, karena diperoleh cDNA yang dapat mempertahankan urutan asli RNA. Tantangan utama menggunakan teknik ini adalah sampel dari mRNA, karena ini dianggap sulit untuk menangani mRNA dengan tingkat dan konsentrasi rendah serta stabilitas yang rendah pada suhu kamar bersama dengan kepekaan terhadap aksi ribonucleases dan perubahan pH.

RT PCR atau Reverse Transcriptase PCR adalah teknik yang digunakan untuk membuat cDNA (complementary DNA) dengan RNA sebagai template-nya. Proses ini adalah kebalikan dari transkripsi DNA menjadi RNA yang umum terjadi pada makhluk hidup, sehingga dinamakan reverse transcription (transkripsi terbalik). Teknik ini merupakan proses PCR dengan menggunakan enzim reverse transcriptase untuk membuat DNA dari template RNA. Reverse transcriptase, atau RNA-dependent- DNA polymerase, merupakan jenis enzim yang biasanya ditemukan pada retrovirus. Enzi mini mensintesis DNA beruntai tunggal. DNA yang dibuat menggunakan template RNA disebut cDNA. cDNA kemudian diteruskan menggunakan proses PCR “normal”, di bawah kendali DNA polymerase, sehingga dapat mensintesis jutaan molekul DNA untai ganda yang mewakili urutan RNA asli.

  4.    Semiquantitative PCR

Teknik ini memungkinkan pendekatan untuk jumlah relative keberadaan asam nukleat dalam sampel. cDNA diperoleh dengan PCR ketika sampel tersebut adalah RNA. Kemudian pengendalian internal (yang digunakan sebagai penanda) diamplifikasi. Penanda yang biasanya digunakan adalah Apo A1 dan B aktin. Produk amplifikasi dipisahkan melalui elektroforesis. Gel agarosa difoto setelah perwarnaan etidium bromide, dan densitas optic dihitung dengan densitometer. Kerugian dari teknik ini adalah kemungkinan hibridisasi nonspesifik, menghasilkan hasil yang tidak memuaskan. Pengendalian spesifisitas dilakukan dengan menggunakan penyelidikan yang sangat spesifik untuk hibridisasi (gambar 5).

   5.   Real-Time PCR

Real time PCR atau kuantitatif PCR (qPCR) merupakan bentuk adaptasi lain dari metode PCR untuk menghitung jumlah penggandaan dari asam nukleat selama PCR. Dengan demikian, qPCR digunakan untuk mengihitung DNA atau cDNA, menentukan jumlah gen atau transkrip yang ada dalam sampel berbeda. qPCR memberikan keuntungan seperti kecepatn memperoleh hasil, mengurangi resiko kontminasi dan kemudahan dalam teknologi penanganan. PCR ini menggunakan deteksi fluorosensi yang umumnya terdiri dari 2 jenis: intercalating agents dan labeled probes dengan fluorophores.

Prinsip kerja Real-TimePCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam reaksi. Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target. Makin tinggi tingkat ekspresi gen target maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjadi. 

   6.   Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Referensi :

Rodriguez, Patricia Hernandez and Arlen Gomez R. 2005. Polymerase Chain Reaction: Types, Utilities and Limitations. Colombia: Universidad de La Salle
http://fatchiyah.lecture.ub.ac.id/teaching-responsibility/general/bbbb/